La fibrosi cistica è la malattia autosomica recessiva grave più comune nella popolazione italiana. La frequenza dei portatori è compresa tra 1 su 26 e 1 su 30. Le manifestazioni cliniche della malattia sono caratterizzate dalla presenza di secrezioni esocrine mucose dense che portano a una malattia polmonare cronica ostruttiva con evoluzione verso l’insufficienza respiratoria. Nell’ambito di una certa variabilità interindividuale si possono avere anche altre manifestazioni cliniche di rilievo, tra cui insufficienza pancreatica esocrina, epatopatia, diabete e, nella quasi totalità dei maschi affetti, azoospermia da atresia bilaterale congenita dei dotti deferenti (CBAVD).
Le modalità di comparsa, l’entità dei sintomi e il decorso sono molto variabili.
Il gene responsabile della malattia si trova sul braccio lungo del cromosoma 7 e contiene 27 esoni. La proteina codificata è chiamata Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), è composta da 1.480 aminoacidi, e la sua funzioneprincipale riguarda il trasporto transmembrana del cloro. Le mutazioni del gene CFTR sono molto numerose: a oggi ne sono state individuate più di 1.600. Non tutte le variazioni di sequenza codificante comportano un quadro clinico compatibile con la malattia: c’è un numero non trascurabile di varianti nucleotidiche che sono associate a forme atipiche, o per le quali non esistono dati sufficienti a definirne il ruolo patogenetico.
La frequenza relativa delle mutazioni è quanto mai variabile in relazione all’area geografica: alcune sono molto più rappresentate in particolari popolazioni, altre sono estremamente rare. La più frequente (F508del) si concentra nella popolazione dell’Europa settentrionale più che in quella meridionale. In Italia F508del è la mutazione di gran lunga più frequente (51%); nell’insieme le 12 mutazioni più diffuse caratterizzano il 73% degli alleli responsabili di malattia, con differenze di rilievo tra regioni geografiche limitrofe e addirittura all’interno della stessa regione. La correlazione tra genotipo e fenotipo non è così stretta da consentire giudizi prognostici sulla sopravvivenza e sull’insorgenza di disturbi respiratori. Alcune mutazioni sono associate a sufficienza pancreatica, a livelli normali o quasi normali di cloro nel sudore e a fertilità maschile.
In relazione alle alterazioni di struttura o di funzione che provocano nella proteina CFTR, le mutazioni sono state suddivise in 5 classi. Le mutazioni di classe I sono quelle che riguardano la produzione vera e propria della proteina: in genere non è prodotta per niente o in scarsa quantità. Le mutazioni di classe II (es: F508del) impediscono che la proteina prodotta “maturi”, vale a dire sia elaborata in modo tale da arrivare e poter funzionare normalmente sulla membrana della cellula.
Con le mutazioni di classe III e IV, la proteina è prodotta, si dispone sulla membrana della cellula e quindi il canale per il cloro esiste, ma è mal regolato (si apre e si chiude con difficoltà ) oppure è poco permeabile al cloro stesso, che dovrebbe passare all’esterno della cellula. Le mutazioni di classe V permettono la produzione di una piccola quantità di proteina funzionante.
A rendere ancora più complessa la struttura del gene CFTR, è la presenza di un polimorfismo (variante) chiamato polyT. In questo tratto la sequenza del DNA del gene è costituita da una serie ripetuta di T (Timina). Queste T possono essere ripetute varie volte: più frequentemente sono ripetute 5 volte (=variante 5T), 7 volte (= variante 7T), 9 volte (=variante 9T). Se prendiamo gli individui della popolazione generale, circa l’80% circa possiede la variante 9T, il 15% la variante 7T, mentre nel 5% è presente la variante 5T. La lunghezza del tratto T condiziona il buon funzionamento del gene e quindi la produzione di una quantità normale di proteina CFTR. In presenza della variante 9T viene prodotta una quantità di proteina pressoché normale; in presenza della variante 7T viene prodotta una quantità di proteina variabile fra il 50 e il 100% del normale (sempre sufficiente però per il buon funzionamento del gene); la variante 5T condiziona la produzione di una quantità ridotta di proteina CFTR, variabile dal 5 al 30%. Questa è la ragione per cui oggi si ritiene che le varianti 7T e 9T siano innocenti, mentre si ritiene che 5T abbia, agli effetti del funzionamento del gene, in un certo numero da casi, un effetto simile a quello di una mutazione.
Il test viene proposto ai familiari di persone affette con rischio di eterozigosi aumentato, a coppie che cercano una gravidanza con tecniche di fecondazione assistita e, talora, a coppie della popolazione generale, soprattutto quelle in attesa di un figlio.
In assenza di fattori di rischio (familiarità per malattia o eterozigosi, atresia bilaterale congenita dei dotti deferenti del maschio nelle coppie che ricorrono alla fecondazione assistita), è indicato un test di I livello in uno o entrambi i componenti della coppia.
L’analisi di I livello eseguita presso il nostro laboratorio permette il rilevamento e l’identificazione di un pannello di 80 mutazioni e del polyT (5/7/9) dell’introne 8 del gene CFTR, associati alla condizione di portatore sano o affetto da fibrosi cistica o patologie CFTR correlate. Pertanto viene offerto ai pazienti un test di I livello che arriva all’85% di detection rate (tasso di individuazione delle mutazioni) rispetto alle mutazioni presenti nella maggior parte delle regioni italiane.
Per l’analisi di II livello viene effettuato il sequenziamento (Next-generation sequencing) di tutto il gene (esoni e regioni introniche fiancheggianti) attraverso l’utilizzo di un sequenziatore Illumina MiSeq DX.
E’ possibile inviare i campioni da analizzare da tutta Italia.
INDICAZIONI CLINICHE
– Soggetti con sospetto clinico di forme classiche di FC
– Soggetti affetti da forme lievi o atipiche di FC
– Familiari degli affetti
– Diagnosi Prenatale in coppie a rischio in cui sono note le mutazioni
– Diagnosi prenatale quando si evidenziano anse intestinali fetali iperecogene
– Partner di soggetti portatori sani o affetti da FC
– Soggetti azoospermici o con grave oligozoospermia da assenza congenita dei dotti deferenti, bilaterale (CBAVD) o monolaterale (CUAVD)
Cystic fibrosis is the most common severe autosomal recessive disease in the Italian population. Carrier frequency is between 1 in 26 and 1 in 30. Clinical manifestations of the disease are characterized by the presence of dense mucous exocrine secretions leading to chronic obstructive pulmonary disease with evolution towards respiratory failure. Within a certain interindividual variability, there may also be other clinical manifestations of importance, including exocrine pancreatic insufficiency, hepatopathy, diabetes and, in almost all affected males, azoospermia due to congenital bilateral atresia of the vas deferens (CBAVD).
The manner of appearance, the extent of symptoms and the course are highly variable.
The gene responsible for the disease is located on the long arm of chromosome 7 and contains 27 exons. The encoded protein is called Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), is composed of 1,480 amino acids, and its main function concerns the transmembrane transport of chlorine. Mutations in the CFTR gene are very numerous: to date, more than 1,600 have been identified. Not all coding sequence variations involve a clinical picture compatible with the disease: there is a non-negligible number of nucleotide variants that are associated with atypical forms, or for which there are insufficient data to define their pathogenetic role. The relative frequency of mutations is more variable than ever in relation to geographical area: some are much more represented in particular populations, others are extremely rare. The most frequent (F508del) is concentrated in the population of northern Europe more than in southern Europe. In Italy F508del is by far the most frequent mutation (51%); overall, the 12 most widespread mutations characterize 73% of the alleles responsible for the disease, with significant differences between neighboring geographical regions and even within the same region. The correlation between genotype and phenotype is not so close as to allow prognostic judgments on survival and occurrence of respiratory disorders. Some mutations are associated sufficiently pancreatic, with normal or near-normal levels of chlorine in sweat and with male fertility.
In relation to the structure or function alterations they cause in the CFTR protein, the mutations have been divided into 5 classes. Class I mutations are those that concern the actual production of the protein: it is generally not produced at all or in small quantities. Class II mutations (e.g. F508del) prevent the protein produced “from maturing”, i.e. from being processed in such a way as to arrive and function normally on the cell membrane.
With class III and IV mutations, the protein is produced, it is arranged on the membrane of the cell and therefore the channel for chlorine exists, but it is poorly regulated (it opens and closes with difficulty ) or it is poorly permeable to the chlorine itself, which should pass outside the cell. Class V mutations allow the production of a small amount of functioning protein. What makes the structure of the CFTR gene even more complex is the presence of a polymorphism (variant) called polyT. In this stretch the DNA sequence of the gene consists of a repeated series of T (Thymine). These Ts can be repeated several times: most frequently they are repeated 5 times (=5T variant), 7 times (= 7T variant), 9 times (=9T variant). If we take individuals from the general population, approximately 80% have the 9T variant, 15% have the 7T variant, while 5% have the 5T variant. The length of the T tract conditions the proper functioning of the gene and therefore the production of a normal amount of CFTR protein. In the presence of the 9T variant, an almost normal quantity of protein is produced; in the presence of the 7T variant, a quantity of protein varying between 50 and 100% of normal is produced (always sufficient for the proper functioning of the gene); the 5T variant affects the production of a reduced quantity of CFTR protein, varying from 5 to 30%. This is the reason why today it is believed that the 7T and 9T variants are innocent, while it is believed that 5T has, for the purposes of the functioning of the gene, in a certain number of cases, an effect similar to that of a mutation. The test is offered to family members of affected people with increased risk of heterozygosity, to couples seeking pregnancy with assisted reproduction techniques and, sometimes, to couples in the general population, especially those expecting a child.
In the absence of risk factors (familiarity due to disease or heterozygosity, congenital bilateral atresia of the male’s vas deferens in couples who resort to assisted fertilization), a level I test is indicated in one or both members of the couple.
Level I analysis performed at our laboratory allows the detection and identification of a panel of 80 mutations and the polyT (5/7/9) of intron 8 of the CFTR gene, associated with the condition of healthy carrier or affected by cystic fibrosis or CFTR-related pathologies. Therefore, patients are offered a level I test that reaches ’85% detection rate compared to the mutations present in most Italian regions.
For level II analysis, sequencing (Next-generation sequencing) of the entire gene (exons and flanking intronic regions) is carried out using an Illumina MiSeq DX sequencer.
E’it is possible to send samples for analysis from all over Italy.
CLINICAL INDICATIONS
– Subjects with clinical suspicion of classic forms of CF
– Subjects suffering from mild or atypical forms of CF
– Affection family members
– Prenatal diagnosis in at-risk couples where mutations are known
– Prenatal diagnosis when hyperechoic fetal intestinal loops are highlighted
– Partners of healthy carriers or those with CF
– Azoospermic subjects or with severe oligozoospermia due to congenital absence of vas deferens, bilateral (CBAVD) or unilateral (CUAVD)